光學(xué)顯微鏡的組織學(xué)樣品制備
概述
組織學(xué)是一個(gè)術(shù)語，指的是組織和細(xì)胞的微觀解剖學(xué)研究。正確的光學(xué)顯微鏡組織學(xué)樣品制備對于從組織樣品中獲得高質(zhì)量結(jié)果至關(guān)重要。
幾乎所有組織學(xué)程序共有3個(gè)主要步驟。shou先，固定樣品，以保護(hù)組織并減緩組織降解。接下來，將樣品浸入具有與其自身相似的機(jī)械性能的材料或包埋介質(zhì)中。包埋后，使用稱為切片機(jī)的精密切割工具將樣品切成薄片或切成薄片。該視頻介紹了這些常規(guī)步驟以及與之相關(guān)的一些概念。
組織樣本固定
組織固定是保存細(xì)胞和組織成分并維持其結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵步驟。細(xì)胞死亡后，天然存在的酶從細(xì)胞器中釋放出來，并開始降解整個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)，從而破壞了細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。固定通過直接抑制這些酶消化蛋白質(zhì)的能力和使酶切位點(diǎn)無法識別來防止這種降解。
固定的兩個(gè)主要機(jī)制是交聯(lián)和凝結(jié)。交聯(lián)涉及蛋白質(zhì)內(nèi)部以及蛋白質(zhì)之間的共價(jià)鍵形成，這會導(dǎo)致組織變硬并因此抵抗降解。凝結(jié)是由于使用酒精或丙酮使蛋白質(zhì)脫水而引起的，這會使蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)變形，從而使疏水或擔(dān)心水的區(qū)域移動蛋白質(zhì)表面。凝結(jié)性固定可以幫助包埋石蠟等介質(zhì)穿透組織。
zui常用的固定劑之一是福爾馬林，它是溶于水中的甲醛。在固定過程中，甲醛附著在伯胺上，例如在賴氨酸和谷氨酰胺氨基酸側(cè)鏈上發(fā)現(xiàn)的那些，形成穩(wěn)定的交聯(lián)鍵，稱為甲苯橋。此過程本質(zhì)上很慢，zui多可能需要1-2天。
固定之前，應(yīng)考慮一些注意事項(xiàng)。shou先，考慮樣品的擴(kuò)散率。固定劑將以與固定劑的擴(kuò)散系數(shù)乘以時(shí)間平方根相關(guān)的速率在組織中擴(kuò)散一定距離。固定劑需要1個(gè)小時(shí)才能穿透1毫米到樣品中，將花費(fèi)25個(gè)小時(shí)才能穿透5毫米。一旦福爾馬林到達(dá)組織中心，就需要發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)基石。因此，為了在合理的時(shí)間內(nèi)徹底固定樣品，樣品的厚度應(yīng)限制為4 mm。
其次，考慮固定劑的體積和pH值。固定劑與樣品的體積比應(yīng)至少為40：1，以使試劑不會隨時(shí)間流逝。盡管某些固定劑的設(shè)計(jì)目的是在酸性pH值下工作，但福爾馬林在磷酸鹽緩沖液中保持中性pH值時(shí)效果zui佳，因此不會產(chǎn)生過多的酸，從而在組織中造成假象。
嵌入和分段
組織學(xué)準(zhǔn)備工作的下一步是嵌入，這涉及到在具有與標(biāo)本本身相似的機(jī)械剛度的介質(zhì)中支撐標(biāo)本。選擇正確的嵌入介質(zhì)至關(guān)重要，因?yàn)槿绻不蛱酰谇衅瑫r(shí)可能會出現(xiàn)缺陷。到目前為止，zui常用于包埋的介質(zhì)是石蠟。
在石蠟包埋之前，必須先通過用乙醇代替組織中的水使樣品脫水，然后再用二甲苯和二甲苯，zui后加熱石蠟。蠟滲入樣品后，將其小心放置并使用模具將其包圍以形成塊。接下來，將樣品附著到組織盒上進(jìn)行切片。
切片是從嵌入塊中切割樣品薄片的過程。切片通常為4-10 µm厚，可用于光學(xué)顯微鏡。
要切割切片，shou先將金屬，玻璃或金剛石刀片固定在切片機(jī)上。然后將樣品放在樣品架中。接下來，將樣品推進(jìn)到切割表面并在刀片上拉出，以形成所需厚度的切片。切片將積聚成薄帶，可以放在載玻片上。
切片后，將樣品放在載玻片上。對于石蠟包埋的樣品，shou先將切片放入溫水浴中，然后將其從水中提起至載玻片上，然后干燥。
應(yīng)用
生物組織的固有對比度很小，因此在組織學(xué)檢查后，玻片通常會用??突出形態(tài)或特定蛋白質(zhì)的染料或抗體染色。進(jìn)行的zui常見的染色是蘇木精和曙紅或H＆E。因?yàn)樗侨绱似毡?，所以已?jīng)制造出許多自動機(jī)器，用H＆E對許多部分進(jìn)行可重復(fù)染色。蘇木精將細(xì)胞核染成藍(lán)色，曙紅將細(xì)胞質(zhì)染成粉紅色，顯示出組織的細(xì)胞形態(tài)。
固定的一個(gè)缺點(diǎn)是蛋白質(zhì)的交聯(lián)可以使其更多地用于標(biāo)記抗體以找到其結(jié)合位點(diǎn)?？梢允褂媒M織的快速冷凍或速凍，而不是使用固定來保存樣品，然后使用稱為冷凍切片的切片技術(shù)
將組織樣品包埋并定向在稱為OCT的特殊冷凍介質(zhì)（或zui佳切割溫度介質(zhì)）中，然后快速冷凍。像其他嵌入介質(zhì)一樣，OCT與樣品的剛度匹配。
冷凍切片機(jī)或低溫恒溫器用于切割冷凍切片，并且該儀器將內(nèi)部溫度保持在-20°C，以使切割刀片和樣品保持涼爽。與石蠟包埋的切片相比，切片后可以將冷凍切片直接直接舉到帶正電的載玻片上。
避免固定的另一種方法是通過瓊脂包埋，即用新鮮制備的液體瓊脂糖覆蓋樣品。當(dāng)瓊脂糖冷卻時(shí)，它將組織鎖定在適當(dāng)?shù)奈恢?，多余的瓊脂糖可以修剪掉?/p>
切片機(jī)是切片機(jī)的另一種選擇，它具有一個(gè)刀片，可以振動并在瓊脂糖包埋的樣品上移動。切片刀用于從瓊脂糖包埋的樣品中產(chǎn)生約50-1000 µm的厚切片。
通常在染色前將樣品從瓊脂糖中取出，然后放在載有諸如真空油脂等物質(zhì)包圍的載玻片上，以防止蓋玻片擠壓樣品。zui好使用共聚焦顯微鏡對其進(jìn)行觀察，以獲得每個(gè)厚切片的高分辨率圖像。
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